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Qué posibilidades tenemos a la hora de analizar la legionella

analisis legionella

Últimamente nos estamos encontrando consultas de clientes que nos indican que les damos valores de legionella <100 ufc/l y nos pregunta que cómo es posible esto si el Real Decreto 865/03 nos indica que el laboratorio debe tener un límite de detección de al menos 100 ufc/l. Con este post pretendemos explicar qué posibilidades tenemos a la hora de analizar la legionella y qué significa utilizar una técnica u otra.

Dado que estamos teniendo muchas consultas sobre las distintas técnicas de Detección y Recuento de Legionella según la norma UNE-ISO 11731, vamos a hablar un poco sobre ellas.

Para el recuento de legionella la norma UNE-ISO 11731 nos permite utilizar dos métodos:

  • Norma UNE-ISO 11731 parte 1: sirve para aguas tratadas y no tratadas, es decir, para todo tipo de matrices. Aquí realizaremos 3 tratamientos a la muestra ya que podrá tener mayor flora acompañante y tenemos que intentar eliminar toda para que la legionella no tenga ninguna competencia a la hora de crecer.
  • Norma UNE-EN-ISO 11731 parte 2: para aguas tratadas de consumo humano (grifo, ducha…) o de baño tratadas (piscinas, jacuzzis…) Esta parte sólo tiene 1 tratamiento ya que la matriz “se supone” que no tiene tanta flora acompañante al estar tratada el agua con desinfectantes.

A continuación explicaremos en qué consiste cada parte:

Parte 1 (UNE- ISO 11731:2007)

Se puede utilizar para todo tipo de matriz, ya sean aguas tratadas (agua de consumo, piscina,) como no tratadas (agua continental, agua industrial…).  Una vez realizada la toma de muestras, ésta se debe llevar lo antes posible al laboratorio y no tiene que exceder los 5 días hasta la realización del ensayo en el laboratorio. Esta técnica es más laboriosa, pues se trata de concentrar la muestra mediante filtración por membrana (habitualmente 1 litro en un volumen final de 5-25mL). A partir del concentrado se realizan 3 tratamientos con el objetivo de poder eliminar la mayor parte de flora acompañante y que así no interfiera en el crecimiento y detección de la legionella.

A partir de la muestra concentrada realizaremos estos 3 tratamientos:

  • Sin tratamiento: Se siembra directamente un volumen del concentrado en una placa de medio de cultivo específico (como por ejemplo GVPC). En este caso, además de la Legionella (estresada, lesionada o sensible a los tratamientos posteriores) podremos detectar flora acompañante, que podría inhibir por competencia su crecimiento.
  • Tratamiento térmico: Una parte del concentrado se somete a un tratamiento térmico a 50ºC y se siembra en la placa. Aquí eliminaremos la flora acompañante que haya más sensible a temperaturas altas y detectaremos la Legionella que puede resistir a esas temperaturas.
  • Tratamiento ácido: Una parte del concentrado se somete a un tratamiento ácido a pH 2,2 y siembra en la placa. De esta manera únicamente detectaremos en la placa aquellas bacterias resistentes a medios ácidos, como por ejemplo la Legionella.

En resumen, a partir de una muestra filtrada y concentrada, habremos sembrado 3 placas, las cuáles se llevan a incubar a 36ºC durante 10 días, en estos 10 días se harán unas 3 o 4 revisiones para ver si hay crecimiento sospechoso de colonias características que se pudiesen corresponder con Legionella.  En caso de que detectásemos colonias sospechosas, seleccionaríamos 3 colonias con la misma morfología y las pasaríamos a dos medios específicos (BCY y BCYE L-Cys) para poder confirmar si efectivamente se trata o no de Legionella.  La Legionella necesita para su crecimiento el aminoácido L-Cysteina y hierro,  el medio BCYE L-Cys no tiene este aminoácido en su composición, por tanto no crecería en este medio, pero sí lo hará en el medio BCYE que sí lo contiene.

Como en esta técnica generalmente se filtra 1 L, los límites que tenemos son de 100 ufc/L a 15000 ufc/L.

El límite de detección y el rango de recuento de esta técnica varían en función del volumen en que se concentre la muestra, y del volumen que se siembre en la placa, en nuestro caso, y para dar cumplimiento a la legislación aplicable, el recuento será de 100 a 15.000 ufc/ L. Este límite se debe a que:

  • concentramos la muestra en 10 mL
  • sembramos en cada placa 0,1 mL
  • en una placa podemos contar entre 1 y 150 colonias (ufc)

Al hacer los cálculos para poder expresar los resultados en 1 litro, el límite de detección obtenido es < 100 ufc/L y el rango de recuento está comprendido entre 100 y 15000 ufc/L. (ufc= unidad formadora de colonias).

Parte 2 (UNE-EN- ISO 11731-2:2008)

Únicamente es aplicable a aguas con baja concentración de microorganismos.

Puesto que se trata de aguas tratadas, el tiempo máximo que puede transcurrir desde la toma de muestras hasta la siembra en el laboratorio, no puede exceder de 2 días.

Este procedimiento es más sencillo, ya que como el agua está tratada y no existe tanta flora acompañante, directamente se filtra la muestra de agua sobre una membrana de color negro (para poder ver con más claridad la morfología característica de las colonias) y se somete la membrana a un tratamiento ácido directamente sobre el filtro (para eliminar la posible flora acompañante, ya que como he comentado anteriormente, Legionella es resistente a pH ácidos, mientras que otras bacterias no lo son). A continuación, añadimos una solución salina (por ejemplo: PAGE) para lavar la membrana y eliminar los restos de solución ácida, y la colocamos en la placa. Se incuba durante 10 días a 36 ºC y se realizan las 3 o 4 revisiones para ver si hay colonias sospechosas. Si tenemos colonias que pueden ser sospechosas en este caso cogeríamos 5 colonias características y las pasaríamos a los medios específicos para la confirmación (BCYE y BCYE L-Cys) y veríamos si crece o no en el medio BCYE L-Cys. Si no crece aquí pero sí en el BCYE se confirmaría que se trata de Legionella.

El límite de detección de esta técnica varía en función del volumen de muestra filtrado y en este caso podrá estar comprendido entre 1 y 100 ufc/ L si el volumen de muestra filtrado es de 1000 mL; o entre 10 y 1.000 ufc/L en caso de que se filtren 100 mL (esto se debe a que en la membrana de filtración que es donde crecen las colonias en esta técnica, podemos contar desde 1 a 100 colonias, por lo que calculamos el resultado para 1 litro de muestra, obtendríamos estos límites).

En resumen, el uso de una u otra técnica dependerá del tipo de agua a analizar, si bien se debe de tener muy en cuenta cuáles son los límites de detección y de recuento de cada una de las técnicas que he comentado anteriormente. Cada laboratorio tendrá unos límites que dependerán del tipo de muestra de agua o matriz, de la técnica empleada, del volumen filtrado y del volumen que se inocule en la placa, tal y como he comentado anteriormente.